2022年11月23日，中國醫學科學院病原生物學研究所孫義成研究團隊、楊劍研究團隊和金奇研究團隊在Science Advances《科學促進》在線發表了題為“Application of combined CRISPR screening for genetic and chemical-genetic interaction profiling in Mycobacterium tuberculosis”（CRISPR敲除及抑制組合文庫篩選在結核分枝桿菌遺傳及化學-遺傳相互作用研究中的應用）的研究論文。首次實現CRISPR敲除文庫在細菌中的構建及應用。
結核分枝桿菌感染引起的結核病仍然是全球公共衛生的威脅。其中，耐藥結核病（Drug-resistant tuberculosis, DR-TB），尤其是耐多藥結核病仍是全球結核病治療和控制的重大挑戰。2022年世界衛生組織發布的《全球結核病報告》顯示，2021年全球新發結核病例1,060萬，其中約45萬例是利福平耐藥結核病，全球范圍內DR-TB的治療成功率僅為60%。因而研發出療效確切、依從性更好的新型抗結核藥迫在眉睫。利用CRISPR系統構建基因組文庫進行高通量篩選，是目前功能基因組學研究的重要工具之一，其中CRISPR敲除和抑制（CRISPRi）文庫已在原核生物及真核生物中得到大規模運用，而CRISPR敲除（CRISPR-KO）文庫篩選尚未在細菌等原核生物中得到應用。
該研究利用前期構建的基于CRISPR和非同源末端連接的分枝桿菌高效基因組編輯技術，在結核分枝桿菌中構建出全基因組CRISPR-KO文庫。利用該CRISPR-KO文庫結合CRISPRi文庫，結合機器學習等生物信息學方法，研究人員分析了結核菌的必需基因，并與已知數據庫進行了比較。研究結果證實了CRISPR-KO文庫篩選的可靠性，同時發現CRISPR-KO和CRISPRi文庫篩選各自具有獨特的優勢和不足，而將它們組合應用將能得到更全面、可靠的篩選結果。隨后，研究人員將CRISPR組合文庫用于抗結核新藥貝達喹啉(BDQ)的化學-遺傳相互作用的研究，發現了結核菌中幾十個影響貝達喹啉耐藥/敏感性的基因（圖1）。
圖1. CRISPR組合文庫在BDQ殺菌中的篩選結果
為驗證所篩選基因的功能，研究人員通過突變株構建等遺傳技術，驗證了兩個篩選得到的基因topA、lprG影響BDQ殺菌能力；通過藥物協同殺菌實驗等，發現這兩個基因的靶標藥物AMSA、LB04-III確實與BDQ具有協同殺菌作用。最后，根據篩選和驗證結果，研究人員揭示了結核菌相關基因影響BDQ殺菌功效的作用機制（圖2）。
該項研究首次報道了CRISPR-KO文庫在細菌中開展功能基因組學研究。該研究構建的結核菌CRISPR組合文庫，可以廣泛應用于抗結核藥物化學-遺傳相互作用的篩選研究，使研究人員可以更加全面地了解結核分枝桿菌的基因功能及其與抗結核藥物的相互作用網絡，從而有助于新型抗結核藥物的研發。此外，這種CRISPR組合文庫篩選也可以應用于其它細菌的功能基因組學及化學-遺傳相互作用研究。
圖2. 結核菌基因影響BDQ殺菌能力的作用機制
該研究得到了中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（CIFMS2021-I2M-1-043）、科技部重點研發計劃（2020YFA0907202）、國家自然科學基金（82002179）等項目的資助。中國醫學科學院病原生物學研究所孫義成研究員、楊劍研究員和金奇教授為本文的共同通訊作者，孫義成課題組博士后閆玫漪、楊劍課題組助理研究員鄭丹丹以及孫義成課題組博士生李斯尚為本文的共同第一作者。
原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add5907
